| 梯度生產(chǎn)器 |
| 發(fā)布日期：2023-08-01 人氣：2853 |
 梯度生成器構(gòu)造簡單，裝配簡易，梯度性能好，有不同規(guī)格備選：RDY-TD15，RDY-TD25，RDY-TD35 小型梯度生成器適
于采用蔗糖或氯化銫溶液制備離心梯度。RDY-TD50，RDY-TD100 大型梯度生成器主要適用于制備線性梯度聚丙烯酰胺凝
膠。
梯度生成器均由雙腔體組成，一個為蓄存腔，一個為混合腔，備有一互通閥，第二個閥門調(diào)控混合腔輸出流量。混合腔中置
一磁力攪拌棒以確保恒定梯度。所有梯度生成器底部平坦，可放置到磁力攪拌器上。
1. 制備平行膠：
平行膠中從上至下變性劑的濃度遞增。這種膠適用于分析大量樣品。
1)與制備標(biāo)準(zhǔn)聚丙烯胺凝膠一樣制備膠板。
2)從丙烯酰胺和兩種變性劑貯存液中取兩份等體積溶液以符合要求的變性劑濃度范圍。溶液的總體積一般為剛好覆蓋膠板。
丙烯酰胺的濃度取決于 DNA 片段的大小，對于 DNA 片段大小為≥300bp 的丙烯酰胺的濃度為 6%，而長度＜300bp 的 DNA 片
段，丙烯酰胺的濃度為 12%。
3)加高濃度變性劑溶液到梯度生成器右槽中(該溶液將首先通過梯度合成器進入膠板間的空隙)，打開連接梯度生成器兩端的
開關(guān)，讓一些溶液流入左槽內(nèi)關(guān)上開關(guān)，用吸管把它們移回到右槽(目的是確保兩槽之間無氣泡的阻隔)。然后把低濃度變性
劑溶液加到梯度生成器左槽中。
4)攪拌這兩個槽中溶液的同時向其中加入 4.5μL/mLl0%的過硫酸銨和 1μL/mL 的 TEMED(N，N，N＇，N＇，—四甲基乙二胺)。
5)輕輕打開兩槽之間的開關(guān)及梯度生成器出口的開關(guān)，灌膠時兩槽內(nèi)的溶液應(yīng)處于攪拌狀態(tài)(尤其高濃度溶液槽更應(yīng)攪拌)，
溶液受重力影響通過一個放在兩塊玻璃板之間的頂部的細塑料管流過梯度生成器。流速應(yīng)保持一定大小以保證溶液在凝聚之
前所有溶液都應(yīng)注入到兩層玻璃板之間。(凝聚速度可通過調(diào)整過硫酸銨和 TEMED 的濃度來調(diào)節(jié))。
6)膠板充滿后，在其頂部插入梳子并將其放平，凝聚至少 30min。(膠可事先灌好并于 4℃貯存幾天)。
2.制備垂直膠：
垂直膠含有丙烯酰胺的濃度是固定的，垂直于電泳方向有一個線性遞增的變性劑梯度。這種膠適用于確定分離含有核苷酸改
變的 DNA 片段的最佳梯度范圍。垂直膠的制備大體相似和平行膠的制備，但也有所不同：
1)像標(biāo)準(zhǔn)的聚丙烯酰胺凝膠一樣制備膠板，但其頂部不插入梳子。
2)準(zhǔn)備一塊比梳子稍短的涂上潤滑劑的間隔片插在梳子的位置，位置稍突出一些，這樣左邊就留下一個缺口。用夾子夾緊這
一邊。把膠板旋轉(zhuǎn) 90°這樣和缺口相連的這一面就轉(zhuǎn)到最上面了。膠液將通過該缺口進入兩玻璃板之間。如前所述的方法
灌膠。
3)膠完全凝固之后，將膠板垂直立起，輕輕移出膠頂部的間隔片。膠的頂部就會出現(xiàn)大而平的孔，這樣就可以進行電泳了。
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